Efficacy of the Benznidazole+Posaconazole combination therapy in parasitemia reduction: An experimental murine model of acute Chagas

Abstract INTRODUCTION: Benznidazole (BZL) and Nifurtimox (NFX) are the pharmacological treatment for acute phase Chagas Disease (CD); however, therapy resistance and residual mortality development remain important unresolved issues. Posaconazole (POS) has shown a trypanocidal effect in vivo and in vitro. Thus, this study aimed at comparing the T. Cruzi parasitic load-reducing effect of the combination of BZL+POS against that of monotherapy with either, during acute phase CD, in an experimental murine model. METHODS Nineteen Wistar rats were randomly allocated to four groups and inoculated with the trypomastigotes of T. cruzi strain´s JChVcl1. The rats were administered anti-parasites from day 20-29 post-infection. The Pizzi and Brener method was used for parasitemia measurement. Longitudinal data analysis for the continuous outcome of repeated measures was performed using parasitemia as the outcome measured at days 20, 22, 24, 27, and 29 post-infection. RESULTS All four groups had similar parasitic loads (p=0.143) prior to therapy initiation. Among the three treatment groups, the BZL+POS (n=5) group showed the highest mean parasitic load reduction (p=0.000) compared with the control group. Likewise, the BZL+POS group rats showed an earlier therapeutic effect and were the only ones without parasites in their myocardial samples. CONCLUSIONS: Treatment of acute phase CD with BZL+POS was more efficacious at parasitemia and myocardial injury reduction, compared with monotherapy with either.

Laboratory genetic-based reference values for cholinesterase activity in a Colombian population: A step forward in personalized diagnostics / Valores de referencia basados en el contexto genético de la actividad enzimática de la colinesterasa en una población colombiana: un paso hacia el diagnóstico personalizado

Introduction: The determination of cholinesterase (ChE) activity has been commonly applied in the biomonitoring of exposure to organophosphate and carbamate pesticides. However, ChE activity is influenced by genetic factors. Integrating genotype and phenotype information in clinical laboratory tests would increase the accuracy of the reference values in well-defined populations. Objective: To establish genetic-based reference values for acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) activity in a Colombian population. Materials and methods: A total of 397 healthy adults from Bucaramanga were included in the study. AChE and BChE activities were measured in blood samples by potentiometry and spectrophotometry, respectively. Genotyping for ACHE rs17880573 and BCHE rs1803274 was performed using the TaqMan allelic discrimination assay. The statistical analyses to obtain the reference values were performed with the MedCalc® software. Results: Allele frequencies were 10.58% for rs17880573 A and 8.82% for rs1803274 A. People with genotypes rs1803274 AA and AG showed a reduction of 20.69% and 10.92% respectively in mean BChE activity compared to people with genotype GG. No significant differences were identified in AChE activity between rs17880573 alleles or genotypes. In the overall sample, the corresponding reference values were as follows: for AChE activity, 0.62-0.98 D pH/h and for BChE activity, 4796.3-10321.1 U/L for people carrying the allele rs1803274A and 5768.2-11180.4 U/L for people carrying the genotype rs1803274 GG. Conclusion: We strongly recommend using these genetic-based reference values for ChE enzymes in our well-defined population in daily clinical practice.

Introducción. La determinación de la actividad enzimática de la colinesterasa se utiliza comúnmente en la vigilancia biológica de la exposición a pesticidas organofosforados y carbamatos. Sin embargo, los factores genéticos afectan la actividad de la colinesterasa, por lo que la integración de la información sobre genotipos y fenotipos en las pruebas de laboratorio clínico, incrementaría la precisión de los valores de referencia. Objetivo. Establecer los valores de referencia basados en el contexto genético para la actividad enzimática de la acetilcolinesterasa (AChE) y la butirilcolinesterasa (BChE), en una población colombiana. Materiales y métodos. Se incluyeron 397 adultos sanos. La actividad de la acetilcolinesterasa y la de la butirilcolinesterasa, se determinaron en muestras de sangre por potenciometría y espectrofotometría, respectivamente. Los genotipos de los ACHE rs17880573 y BCHE rs1803274 se obtuvieron mediante el ensayo TaqMan y los valores de referencia se estimaron con el programa MedCalc®. Resultados. La frecuencia alélica fue de 10,58 % para rs17880573 A y de 8,82 % para rs1803274 A. Las personas con los genotipos rs1803274 AA y AG, mostraron una reducción en el promedio de la actividad de la butirilcolinesterasa de 20,69 % y de 10,92 %, respectivamente, comparados con aquellas con el genotipo GG. No se encontraron diferencias significativas en la actividad de la acetilcolinesterasa con respecto a los alelos y genotipos del rs17880573. Los valores de referencia determinados para esta población fueron de 0,62-0,98 D pH/h para acetilcolinesterasa y de 4796,3-10321,1 U/L para butirilcolinesterasa, en las personas portadoras del alelo rs1803274 A, y de 5768,2-11180,4 U/L, en las portadoras del genotipo rs1803274 GG. Conclusión. Se recomienda el uso de estos valores de referencia basados en el contexto genético para las colinesterasas, en la práctica clínica diaria en esta población.

Comparison of seven diagnostic tests to detect Trypanosoma cruzi infection in patients in chronic phase of Chagas disease / Comparación de siete pruebas diagnósticas para detectar infección por Trypanosoma cruzi en pacientes en fase crónica de la enfermedad de Chagas

Objective: To compare the diagnostic performance of seven methods to determine Trypanosoma cruzi infection in patients with chronic Chagas disease. Methods: Analytical study, using the case-control design, which included 205 people (patients with Chagasic cardiomyopathy, n= 100; control group, n= 105). Three enzyme linked immunosorbent assays, one indirect hemagglutination assay and one immunochromatographic test were assessed. Additionally, DNA amplification was performed via the PCR method using kinetoplast and nuclear DNA as target sequences. For the comparative analysis of diagnostic tests, the parameters used were sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, Receiver Operator Characteristic (ROC), positive and negative likelihood ratio, as well as κ quality analysis. Results: The commercial Bioelisa Chagas test showed the highest sensitivity (98%), specificity (100%), and positive and negative predictive values; additionally it had the highest discriminatory power. Otherwise, the amplification of T. cruzi DNA in blood samples showed low values of sensitivity (kinetoplast DNA= 51%, nuclear DNA= 22%), but high values of specificity (100%), and moderate to low discriminatory ability. Conclusion: The comparative analysis among the different methods suggests that the diagnostic strategy of T. cruzi infection in patients with chronic Chagas disease can be performed using ELISA assays based on recombinant proteins and/or synthetic peptides, which show higher diagnosis performance and can confirm and exclude the diagnosis of T. cruzi infection. The molecular methods show poor performance when used in the diagnosis of patients with chronic Chagas disease.

Objetivo: Comparar la capacidad diagnóstica de siete métodos para determinar infección por Trypanosoma cruzi, en pacientes con enfermedad de Chagas crónica. Métodos: Estudio analítico de casos y controles, que incluyó 205 personas (pacientes con miocardiopatía chagásica, n= 100; grupo control, n= 105). Se evaluaron tres inmunoensayos enzimáticos, una hemaglutinación indirecta y una inmunocromatografia. Adicionalmente, se realizó amplificación de ADN de T. cruzi por reacción en cadena de la polimerasa utilizando como secuencias diana ADN de kinetoplasto y nuclear. Para el análisis comparativo de las pruebas diagnósticas, los parámetros utilizados fueron sensibilidad, especificidad, valores predictivo positivo y negativo, análisis ROC, razón de verosimilitud positiva y negativa, así como análisis de calidad κ. Resultados: La prueba Bioelisa para Chagas mostró la mayor sensibilidad (98%), especificidad (100%) y valores predictivos positivo y negativo; además ésta tuvo el mayor poder discriminatorio. En contraste, los ensayos de amplificación de ADN de T. cruzi mostraron baja sensibilidad (ADN de kinetoplasto= 51%, ADN nuclear= 22%), alta especificidad (100%) y de moderada a baja capacidad discriminatoria. Conclusión: El análisis comparativo entre los métodos sugiere utilizar como estrategia diagnóstica en pacientes crónicos con enfermedad de Chagas, los ensayos de ELISA con proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos por mostrar un rendimiento diagnóstico superior y tener la capacidad de confirmar y descartar el diagnóstico de infección por T. cruzi. Los métodos moleculares muestran pobre rendimiento para ser utilizados en el diagnóstico de pacientes en fase crónica con enfermedad de Chagas.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus causes both c ommunity-associated and health care-associated infections in children at the Hospital Universitario de Santander / Staphylococcus aureus resistente a meticilina causante de infecciones comunitarias y de infecciones asociadas a la atención en salud en pacientes pediátricos del Hospital Universitario de Santander

Introduction: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a frequent cause of infection in the pediatric population. Initially, MRSA was restricted to hospitals; however, outbreaks in the community among people without health care-related risk factors have been reported worldwide. Currently, MRSA is a frequent cause of both hospital and community-associated infections. Objective: To describe the relationships between the molecular characteristics of MRSA isolates (staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) type and Panton-Valentine leukocidin (PVL) carriage) and the characteristics of infection (the origin and localization of infection) in pediatric patients at the Hospital Universitario de Santander in Bucaramanga, Colombia. Materials and methods: A total of 43 MRSA isolates were obtained from hospitalized pediatric patients. SCCmec typing (I-V), SCCmec IV subtyping and PVL carriage were determined and related to the clinical characteristics. Results: Among the MRSA isolates studied, SCCmec IVc was present in 77%, followed by 16% for SCCmec I and 2% for SCCmec IVa. Two isolates were not typeable (NT). PVL genes were carried by 88% of the MRSA isolates, including the SCCmec IVc/IVa and SCCmec I isolates. SCCmec IV caused both community-acquired infection (CAI) (47%) and nosocomial infection (HAI) (53%). SCCmec IV, PVL-positive MRSA was associated with both CAI (47%) and HAI (53%) and caused mostly SSTI and osteoarticular infection. Conclusions: These findings suggest that the presence of community-associated MRSA (CA-MRSA) (SCCmec IV and PVL positive) causes both health care-associated infection (HCAI) and nosocomial infection (HAI) in pediatric patients in Colombia.

Introducción. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) es un agente frecuente de infección en la población pediátrica. Aunque inicialmente las cepas de SARM estaban restringidas a los hospitales, se han reportado a nivel mundial brotes de infección por SARM en individuos sin factores de riesgo y, actualmente, SARM es una causa frecuente de infecciones hospitalarias y comunitarias. Objetivo. Describir la relación entre las características moleculares de aislamientos de SARM (casete cromosómico estafilocócico mec SCCmec y leucocidina Panton-Valentine) y el origen de la infección y su presentación clínica en pacientes pediátricos del Hospital Universitario de Santander en Bucaramanga, Colombia. Materiales y métodos. Se incluyeron 43 aislamientos de SARM obtenidos de niños hospitalizados. La clasificación del SCCmec (I-V) y la subclasificación del SCCmec-IV se realizaron en todos los aislamientos. Además, los genes de la leucocidina Panton-Valentine se detectaron mediante amplificación por PCR. Las características moleculares fueron asociadas con las características clínicas de cada paciente. Resultados. Entre los 43 SARM tipificados, el SCCmec-IVc fue el más frecuente con 77 %, seguido por el SCCmec-I con 16 % y el SCCmec-IVa con 2 %. Tres aislamientos no pudieron ser tipificados. Los genes de la leucocidina Panton Valentine se detectaron en 88 % de los SARM en aislamientos portadores del SCCmec-IVc/IVa y el SCCmec-I. Los SARM SCCmec-IV positivos para la leucocidina Panton-Valentine se asociaron con infecciones adquiridas en la comunidad (47 %) y en el hospital (53 %) con compromiso de piel y tejidos blandos, y en los casos más graves, con compromiso osteoarticular. Conclusiones. Estos resultados sugieren la presencia de cepas SARM-CO (SCCmec-IV positiva para PVL) causantes de infecciones adquiridas en la comunidad y en el medio hospitalario en pacientes pediátricos en Colombia.

Expresión diferencial entre estadios de Trypanosoma cruzi I en el aislamiento de un paciente con cardiomiopatía chagásica crónica de zona endémica de Santander, Colombia / Differential protein expression in developmental stages of Trypanosoma cruzi I isolated from a patient with chronic chagasic cardiomyopathy

Introducción. Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas. Durante la infección en los huéspedes mamíferos, se observan dos formas del parásito: tripomastigotes y amastigotes. En el curso de la diferenciación del parásito cada estadio expresa un patrón de proteínas específicas de fase, las cuales son responsables de sus características morfológicas, bioquímicas y biológicas, que podrían estar determinando un papel importante en la capacidad infecciosa, virulencia y supervivencia del parásito. Objetivo. Analizar la expresión diferencial entre los estadios tripomastigote y amastigote de un aislamiento de T. cruzi I, utilizando la electroforesis en dos dimensiones y la identificación de las proteínas diferencialmente expresadas mediante espectrometría de masas. Materiales y métodos. Se utilizó un clon del aislamiento MHOM/07/338 de T. cruzi I y, mediante electroforesis en dos dimensiones, se compararon los perfiles proteicos de los estadios tripomastigote y amastigote del parásito. Las imágenes se analizaron con el software PDQuest y las proteínas diferencialmente expresadas se identificaron por MALDI TOF o LC MS/MS. Resultados. Los geles bidimensionales mostraron un promedio de 325 manchas proteicas en cada estadio. En los análisis comparativos se detectaron 21 manchas "sobre expresadas" en el estadiotripomastigote y 30, en el estadio amastigote. Se seleccionaron 16 proteínas para identificación por espectrometría de masas y se clasificaron en diferentes categorías funcionales. Conclusiones. Las proteínas exclusivas de T. cruzi relacionadas, principalmente, con metabolismo glucolítico y ensamble del citoesqueleto, fueron las que presentaron una mayor expresión diferencial entre los estadios tripomastigote y amastigote del parásito. Estas proteínas podrían ser utilizadas para el diseño de fármacos.

Introduction. Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease. During infection inmammalian hosts, two main forms of the parasite are observed: trypomastigotes and amastigotes. During differentiation, each stage of the parasite expresses a pattern of proteins specific to each phase-proteins which are responsible for the cell’s morphological, biochemical and biological properties. These properties ultimately govern the infectivity, virulence and survival of the parasite. Objective. A differential expression analysis was conducted to compare trypomastigote and amastigote stages of T. cruzi I isolate, and to identify proteins differentially expressed by means of mass spectrometry. Materials and methods. A T. cruzi clone of the strain MHOM/07/338 was used to analyze the differential expression between trypomastigote stages of a T. cruzi isolate, using two-dimensional electrophoresis and identification of diferentially expressed proteins by mass spectrometry. The protein profiles of the stages of the parasite were obtained by two-dimensional gel electrophoresis and visualized in gels dyed with Coomassie blue. The images were analyzed with PDQuest software and the differential expression of the proteins was identified by MALDI TOF or LC MS/MS. Results. The two-dimensional gels revealed an average of 325 protein spots in each stage. The comparative analyses detected 21 spots that were over expressed in the trypomastigote stage and 30 in the amastigote stage. Sixteen of the over expressed proteins were selected for identification by mass spectrometry and classified in several functional categories. Mass spectrophotometry determined that the proteins were associated mainly with glucolytic metabolism and assembly of the cytoskeleton constituents. Conclusions. The differential expression between trypomastigote and amastigote stages consisted of proteins specific to T. cruzi and are potential targets for the design of treatment drugs.

Polymorphisms of toll-like receptor 2 and 4 genes in Chagas disease

The aim of this study was to test the possible implication of toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 gene polymorphisms in determining the susceptibility to Chagas' disease. Genotypes were determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism in 475 individuals from Colombia, 143 seropositive with chagasic cardiomyopathy, 132 seropositive asymptomatic and 200 seronegative. The TLR2 arginine to glutamine substitution at residue 753(Arg753Gln) polymorphism was absent in the groups analyzed. The TLR4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms are in linkage disequilibrium and we observed a very low frequency of these polymorphisms in our study population (2.6 percent and 1.8 percent respectively). The overall TLR2 and TLR4 alleles and genotype distribution in seronegative and seropositive were not significantly different. We compared the frequencies between asymptomatic patients and those with chagasic cardiomyopathy and we did not observe any significant differences in the distribution of alleles or genotypes. In summary, this study corroborates the low frequency of TLR2 and TLR4 polymorphisms observed in other populations and suggest that these do not play an important role in Chagas' disease. The validation of these findings in independent cohorts is needed to firmly establish a role for TLR2 and TLR4 variants in Chagas' disease.

Polimorfismos de la región promotora del gen de la IL-10 y artritis reumatoide en una población colombiana / Polymorphisms of IL-10 gene promoter and rheumatoid arthritis in a Colombian population

Introducción. La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria con un predominio de la actividad de las células TH1 CD4+. La interleucina-10, presente en altas concentraciones en suero y líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide, tiene una marcada actividad antinflamatoria, al mismo tiempo que estimula las células B y la generación de autoanticuerpos. La producción de la interleucina-10 está bajo control genético. Objetivo. En este estudio analizamos los polimorfismos de la región promotora de la interleucina-10 -1082, -819 y -592 en pacientes con artritis reumatoide y en una población control, y su asociación con edad de inicio de la enfermedad, presencia y títulos de factor reumatoideo e historia de reemplazo articular. Materiales y métodos. Se estudiaron 102 pacientes con artritis reumatoide y 102 controles. La genotipificación se realizó por reacción en cadena de la polimerasa, iniciador específico de secuencia. Los tres polimorfismos están en marcado desequilibrio de unión y forman tres haplotipos –1082A/-819C/-592C, –1082A/-819T/-592A y –1082G/-819C/-592C. Resultados. No se encontró asociación de la artritis reumatoide con las diferentes variaciones alélicas, haplotípicas ni genotípicas del promotor de la interleucina-10. Tampoco se encontraron diferencias significativas con inicio de la enfermedad, presencia y títulos de factor reumatoideo e historia de reemplazo articular. Conclusiones. La interleucina-10 es uno de los principales reguladores de la respuesta inmune y por lo tanto podría jugar un papel importante en la patogénesis de la artritis reumatoide; sin embargo, nuestros resultados no dan evidencia de una asociación genética entre los polimorfismos estudiados y el desarrollo o gravedad de la artritis reumatoide.

Introduction. Rheumatoid arthritis is an inflammatory disease driven by TH1 CD4+ cells. Interleukin-10 is present in higher concentrations in serum and synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis and has a marked anti-inflammatory activity. Furthermore, it is capable of stimulating B cells and increasing autoantibody production. Interleukin-10 synthesis is under genetic control. Objective. Three polymorphisms of the promoter region were analyzed for interleukin-10 genes -1082, -819 and -592. Subjects were patients with rheumatoid arthritis compared with a control population for these genes. Material and methods. One hundred two patients with rheumatoid arthritis and 102 matched healthy controls were studied. The following data were taken from the rheumatoid arthritis patients: age of disease onset, presence and titers of rheumatoid factor, and history of replacement joint surgery. Genotypes were obtained by polymerase chain reaction and sequence-specific primer method. The three polymorphisms are in strong linkage-disequilibrium and form three haplotypes –1082A/-819C/-592C, –1082A/-819T/-592A y –1082G/-819C/-592C. Results. No association was detected between Interleukin-10 alleles, haplotypes/genotypes and rheumatoid arthritis. No significant differences occurred between interleukin-10 polymorphisms and age of disease onset, presence and titer of rheumatoid factor and history of major joint replacement. Conclusions. Interleukin-10 is an important regulator of the immune response and likely plays a role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. The current results suggested that Interleukin- 10 promoter polymorphisms were not important for development or severity of rheumatoid arthritis.

Polimorfismos en la región promotora del gen del TNF alfa en artritis reumatoidea / Polimorfism in TNF alpha gene promoter region in arthritis rheumatoid

El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia y potencial relevancia de los polimorfismos del gen TNFA -308 y –238 en la susceptibilidad y severidad de la artritis reumatoidea (AR). Se determinaron las frecuencias genotípicas y alélicas de los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) en 102 casos con AR y 102 controles sanos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias genotípicas o alélicas de los polimorfismos analizados cuando se compararon los pacientes con AR y el grupo control. La frecuencia del genotipo TNFA –238 GA, mostró una tendencia a la asociación con el inicio tardío de la patología, ≥45 años (p=0,046) y con ausencia de cirugía. El polimorfismo TNFA -308A mostró una tendencia, no significativa estadísticamente, con niveles altos de factor reumatoideo (FR) (p=0,06). Las frecuencias genotípicas y alélicas difieren de las reportadas en población antioqueña y son comparables con algunas poblaciones caucásicas. Los resultados de este estudio sugieren que en nuestra población estos polimorfismos están más relacionados con la severidad que con susceptibilidad al desarrollo de la AR.

The aim of this study was to determine the frequency and potential relevance of the TNFA gene polymorphisms -308 and -238 in the susceptibility and severity of rheumatoid arthritis (RA). The genotype and allelic frequencies of simple nucleotide polymorphisms (SNPs) were determined in 102 cases with RA and 102 healthy controls. There were not statistically significant differences between the genotype and allele frequencies of the polymorphisms analyzed when the patients where compared with the controlgroup. The frequency of the genotype TNFA -238AG, showed a tendency with a late beginning of the pathology, ≥45 years(p=0.046) and without surgery. The allele TNFA -308A showed a not significant statistically tendency, to high levels of rheumatoid factor (RF) (p=0.06). The genotype and alellic frequencies differ of those reported in “antioqueña” population and they are comparable with some Caucasian populations. The results of this study suggest that in our population these polymorphisms are more related with the severity that with susceptibility to the development of RA.

Resumen del taller sobre el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para distinguir entre Trypanosoma cruzi y Trypanosoma rangeli / Summary of the workshop: use of the polymerase chain reaction (PCR) to differentiate Trypanosoma cruzi from Trypanosoma rangeli

Este taller se realizó con el propósito de transferir la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de T. cruzi y T. rangeli a laboratorios en Colombia involucrados en el diagnóstico y estudios epidemiológicos de la enfermedad de Chagas. Para demostración de la técnica se utilizaron muestras clínicas y epidemiológicas de áreas endémicas colombianas. En los ensayos se emplearon muestras de tripanosomas provenientes de diferentes medios de cultivo para evaluar el posible efecto de los componentes de estos medios sobre la sensibilidad de PCR. Se hizo extracción de ADN utilizando los métodos de ebullición, lisis hipotónica y geneclean. El ADN se amplificó utilizando oligonucleótidos sintéticos, correspondientes a una secuencia conservada de 22 nucleótidos dentro de un gen mini-exón. Los dos organismos fueron distinguidos por las movilidades electroforéticas de sus respectivos productos de amplificación, confirmando su identidad con sondas intergénicas específicas de especie, marcadas con digoxigenina dUTP. La hibridación se visualizó con la reacción de color del NBT. De un total de 28 muestras analizadas, se lograron 17 identificaciones que coincidieron con la clasificación original. De cinco muestras desconocidas, tres fueron identificadas como T. rangeli y dos como infecciones mixtas. Se presentaron resultados ambiguos en dos muestras, ocasionados por contaminación en PCR. Solamente dos muestras no se pudieron identificar mediante PCR por problemas en la extracción del ADN de la muestra. Teniendo en cuenta estos resultados preliminares se abre la posibilidad de utilizar esta técnica como una herramienta útil o método adicional a las técnicas de rutina para detectar y diagnósticar la enfermedad de Chagas en Colombia